根据茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis oblique nucleopolyhedrovirus, EoNPV）基因序列设计一对引物,并从感染该病毒的虫体中提取EoNPV基因组DNA,进行PCR扩增,将该基因片段与载体pMD18-T连接,转化入大肠杆菌TG1中,经单克隆菌落筛选及测序鉴定后得到重组质粒,以该质粒为荧光定量PCR标准品模板稀释后建立标准曲线。构建的标准曲线线性关系良好,相关系数为0.989,检测范围为103~108拷贝/µL,特异性和重复性较好。该方法可以准确地判断出病毒拷贝数,为茶尺蠖核型多角体病毒在虫体内增殖动态的研究和病毒制剂的质量检测提供了方法依据。
A pair of primer was designed according to the Ectropis oblique nucleopolyhedrovirus (EoNPV) genome DNA sequence. Virus DNA was extracted from the tea looper larvae, Ectropis oblique which were infected with the EoNPV. The DNA fragment was amplified, then cloned into pMD18-T vector and transferred into E. coli TG1. A single clone was selected and sequenced, and the extracted recombinant plasmid DNA was used as a positive quantitative template to establish a standard curve. The standard curve showed a linear relationship between cycle threshold (CT) and template concentration ranging from 103~108 copies/µL with a correlation coefficient of 0.989, and the quantitative PCR was more repeatable and specific than traditional PCR. The fluorescent quantitative PCR method for detecting EoNPV was developed, providing a basis for the research of EoNPV replicating in the host body and quantitative detection of the EoNPV in biopesticide products.
[1] 张益民, 王学兰, 张世敏. 茶尺蠖核型多角体病毒超微结构的初步研究[J]. 科学通报, 1985(24): 1918-1920.
[2] 殷坤山, 陈华才. 喷施茶尺蠖病毒杀虫剂对茶叶品质的影响[J]. 中国茶叶, 2002, 24(4): 5.
[3] 赵丽, 崔保安, 陈红英, 等. 实时荧光定量PCR检测伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用[J]. 中国兽医学报, 2009, 29(4): 433-436.
[4] 王云龙, 陈小科, 韩洁, 等. H3亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 动物医学进展, 2009, 30(6): 30-35.
[5] 袁亚男, 刘文忠. 实时荧光定量PCR技术的类型、特点与应用[J]. 中国畜牧兽医, 2008, 35(3): 27-30.
[6] 李长青, 金海, 栗原光规. 瘤胃甲烷菌实时荧光定量PCR方法的构建[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2009, 9(上): 13-15.
[7] 罗阿东, 唐源, 文明, 等. 山羊痘病毒SYBR Green I荧光PCR检测方法的建立[J]. 山地农业生物学报, 2009, 27(6): 503-507.
[8] Ma XC, Xu H J, Mei J T, et al. Genome sequence and organization of a nucleopolyhedrovirus that infects the tea looper caterpillar, Ectropis oblique[J]. Microbiol, 2006, 44(1): 77-82.
[9] Hughes D S, Possee R D, Ling I A.Activation and detection of a latent baculovirus resembling Mamestra brassicae nuclearpolyhedro-sis virus in M. buassicae insect[J]. Virology, 1993(194): 608-615.
[10] 陈尚武, 魏永杰, 龙綮新, 等. 杆状病毒p10基因及蛋白结构与功能的研究进展[J]. 中国病毒学, 1998, 13(3): 185-191.
[11] 王爱民. 实时荧光定量PCR(TaqMan)法测定外源基因的拷贝数[J]. 2009, 29(3): 408-412.
[12] 王学波, 李建远. 人线粒体DNA荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 生物医学工程研究, 2008, 27(4): 298-301.
[13] 王霞, 蒋伟娇, 周双海, 等. 猪GM-CSF荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 北京农学院学报, 2009, 24(2): 51-56.
[14] 王云龙, 刘建营, 韩洁, 等. 猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 动物医学进展, 2009, 30(5): 36-40.
[15] 李馨, 肖翠红, 张才, 等. 鹅GHR基因荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 中国家禽, 2009, 31(5): 23-26.
[16] 唐泰山, 邓碧华, 王凯民, 等. 牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 动物医学进展, 2009, 30(4): 14-16.
[17] 任聪, 陈信忠, 龚艳清, 等. 实时荧光定量PCR法检测对虾皮下和造血器官坏死病毒[J]. 中国动物检疫, 2009, 26(2): 38-41.
[18] 谢丽基, 谢芝勤, 庞耀珊, 等. 对虾IHHNV荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 水生态学杂志, 2008, 1(2): 132-135.
[19] 舒剑波, 张瑞, 董茵, 等. 大鼠bFGF基因荧光定量PCR检测方法[J]. 中国骨质疏松杂志, 2008, 14(1): 1-4.
[20] 杨禾, 孟姝, 赵蕾, 等. 应用实时荧光定量PCR检测慢性牙周炎患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌[J]. 现代口腔医学杂志,2008,22(2): 143-146.
[21] 魏佳雪, 杨昕, 伍海鹰, 等. 荧光定量技术应用于早孕期胚胎染色体检查的研究[J]. 暨南大学学报, 2008, 29(2): 157-161.
[22] 呼和, 嘎尔迪, 贾仙宝, 等. 用实时荧光定量PCR技术检测奶牛瘤胃纤维降解菌相对定量方法的研究[J]. 科学研究, 2008(2): 10-13.
[23] 拜延阳, 杨增歧, 吴志明, 等. 猪链球菌9型荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J]. 西北农林科技大学学报, 2008, 36(1): 7-12.
[24] 任伟成, 王崇明, 孙世春, 等. 栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒荧光定量PCR检测方法的建立和应用[J]. 中国水产科学, 2009, 16(4): 564-571.
[25] 张永安, 仲国立, 侯玉霞, 等. 茶尺蠖多角体病毒(EoNPV)的PCR检测方法及其生物活性研究[J]. 林业科学研究, 2008(21): 445-455.
[26] 杨发龙, 岳华, 张焕容, 等. Real-time PCR在病毒学研究中的应用[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2008(3): 22-23.
浙公网安备 33019902000101号 
