茶树简化EcoTILLING技术的建立

doi:10.13305/j.cnki.jts.2010.01.004

茶叶科学 ›› 2010, Vol. 30 ›› Issue (1): 19-26.doi: 10.13305/j.cnki.jts.2010.01.004

茶树简化EcoTILLING技术的建立

金基强, 陈亮^*, 姚明哲, 王新超, 马春雷

中国农业科学院茶叶研究所茶树资源与改良研究中心/国家茶树改良中心,浙江杭州 310008

收稿日期:2009-07-31 修回日期:2009-09-30 发布日期:2019-09-10
通讯作者: liangchen@mail.tricaas.com
作者简介:金基强（1983—）,男,河南信阳人,助理研究员,主要从事茶树遗传育种研究
基金资助:
国家“863”计划(2006AA10Z171)、国家自然科学基金（30901159）、“现代农业（茶叶）产业技术体系建设专项资金”、“十一五”国家科技支撑计划（2006BAD13B06）、公益性行业（农业）科研专项（3-35-02）和浙江省自然科学基金（Y3090041）资助

Simplification of EcoTILLING Technique for Tea Plant

JIN Ji-qiang, CHEN Liang^*, YAO Ming-zhe, WANG Xin-chao, MA Chun-lei

Research Center for Tea Germplasm and Improvement, Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences/ National Center for Tea Improvement, Hangzhou 310008, China

Received:2009-07-31 Revised:2009-09-30 Published:2019-09-10

摘要/Abstract

摘要： EcoTILLING（Ecotype Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）可快速检测自然群体中的SNP(Single Nucleotide Polymorphism)等DNA变异。第一次建立了简化的茶树EcoTILLING技术体系：首先筛选扩增目的基因的特异PCR引物;然后通过CELⅠ酶切PCR产物优化实验,确定酶切时间20 min、10×buffer组成为250 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）、150 mmol/L KCl、15 mmol/L MgSO₄、4 μg/mL BSA和0.04% Triton x-100,反应温度为47.5℃,酶量为1.8 µL CJE(Celery Juice Extract)/10 μL反应体系时,酶切的谱带信号较强、特异性高;初步确定合适的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条件为凝胶浓度5%、上样量4~5 μL、有效分离长度要达到15 cm。利用上述简化的EcoTILLING对6份茶树种质870 bp的PPO基因片段实现了分型,经测序验证酶切产生的谱带与6份种质内部或不同种质间的SNP位置吻合。

关键词: 茶树, CEL I, EcoTILLING, SNP

Abstract: EcoTILLING(Ecotype Targeting Induced Local Lesions In Genomes) had been used as a SNP(Single Nucleotide Polymorphism) discovery tool to examine DNA variation in natural populations. A simple EcoTILLING technique for tea plant was established. Firstly, specific PCR primers for the amplification of the target gene were screened out. Then through comparison, a fine CELⅠ enzyme digestion could be resulted using 20 min with 10× buffer containing 250 mmol/L Tris-HCl (pH7.4), 150 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgSO₄, 4 μg/mL BSA and 0.04%Triton x-100, and 1.8 μL CJE(Celery Juice Extract)/10 μL reacting solution at 47.5℃. Moreover, a good picture could be obtained when using 5% polyacrylamide gels (PAGE), adding 4~5 μL digesting products in PAGE electrophoresis. The 870 bp fragment within the PPO (Polyphenol Oxidase) gene of 6 tea germplasms was distinguished from each other using the simplified EcoTILLING. The CELⅠdigested bands were ascertained that according to the position of SNP in or between the 6 accessions through sequencing verification.

Key words: tea plant, CEL I, EcoTILLING, SNP

中图分类号:

S571.1
Q55

金基强, 陈亮, 姚明哲, 王新超, 马春雷. 茶树简化EcoTILLING技术的建立[J]. 茶叶科学, 2010, 30(1): 19-26. doi: 10.13305/j.cnki.jts.2010.01.004.

JIN Ji-qiang, CHEN Liang, YAO Ming-zhe, WANG Xin-chao, MA Chun-lei. Simplification of EcoTILLING Technique for Tea Plant[J]. Journal of Tea Science, 2010, 30(1): 19-26. doi: 10.13305/j.cnki.jts.2010.01.004.

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